IPS诱导肠类器官的培养过程分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导、以及类器官的培养。本文将集中探讨第三阶段——类器官培养，时间范围为14至28天。

一、准备工作

在进行类器官培养之前，需准备一系列试剂和耗材。以下是所需的材料：

• 人正常肠类器官培养试剂盒 (abs9545)
• 低因子、无酚红的基质胶 (abs9495)
• 15ml离心管 (abs7102)
• 15ml EP管若干 (abs7119)
• 24孔细胞培养板 (abs7035)
• 金属冰盒

二、操作流程

1. 加胶、点板与加液

操作流程的核心在于如何有效地将基质胶与细胞混合：

1. 准备工作：
   • 基质胶需在4℃的冰箱中放置一夜以融化。
   • 枪头和离心管需提前在-20℃冰箱中预冷至少半小时。
   • 融化后的基质胶应在4℃保存，建议在2周内使用。
2. 接种要求：在24孔板中，每孔加入25μl基质胶球状体混合物和500-750μl类器官培养基。
3. 接种密度：建议按照1:1的比例进行接种，确保良好的生长环境。
4. 加胶与点板：在冰上进行操作，确保在半分钟内完成以确保基质胶的流畅性。
5. 加液：将培养板放入37℃培养箱中40-60分钟，使基质胶成胶，再开始培养。经过约10-14天后，类器官会达到适合传代的大小。

2. 类器官传代

对于重量适中或数量较多的类器官，传代的具体步骤如下：

1. 类器官收集与洗涤，通过加入4℃类器官传代培养缓冲液轻柔吹散基质胶。
2. 接着，利用离心机以300g在4℃下离心，以分离类器官与基质胶。
3. 若遇到两层液体的情况，需重复洗涤步骤以确保清晰分层，最后保留类器官沉淀。
4. 为避免基质胶过快固化，选择适当的离心机与温度至关重要。

三、冷冻保存

在类器官快速生长的阶段，准确的冷冻保存方法非常重要：

1. 类器官不需要消化，推荐在其生长的高峰期进行冷冻。
2. 收集类器官与冷冻液后，立即进行轻柔重悬。
3. 实施梯度冻存，将样品放入-80℃保存过夜，再移入液氮罐中。

四、复苏过程

复苏时，应尽量快以减少对类器官的损伤：

1. 将水浴锅预热至37℃，并进行实验室灭菌以确保无菌环境。
2. 快速解冻冻存管并转移至超净台内。
3. 添加适量的类器官培育缓冲液以重悬类器官，并进行离心。
4. 最后，按照之前的加胶、点板与加液步骤进行复苏培养。

关键注意事项

• 全程冰上操作可有效避免基质胶提前固化。
• 确保细胞在内胚层分化前的融合度达到85-90%。
• 使用新鲜配制的生长因子以保持活性，避免反复冻融。
• 保持无菌操作并定期进行支原体检测。

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