在生物医疗研究中,实验室培养的细胞可根据其类型大致分为三类:
(1)贴壁细胞:这些细胞会粘附于培养容器(例如组织培养塑料)。
(2)悬浮细胞:这些细胞在生长培养基中自由悬浮,并不附着在容器表面。
(3)半贴壁细胞:某些细胞大致粘附于容器,而另一些细胞可能保持悬浮状态。
细胞也可以根据其生长特性进行分类,主要分为有限增殖和无限增殖:
有限增殖的细胞仅能维持有限的增殖能力,典型的例子为从组织中直接分离的原代细胞,或在一定传代次数后停止生长(衰老)的细胞系。
无限增殖的细胞则具有无限分裂能力,通常通过转化获得类似癌症的表型(例如失去接触抑制、无限生长)。
本文将重点讲解最常见的细胞类型:贴壁细胞和悬浮细胞。请注意,所有涉及细胞操作的过程均须在无菌条件下进行,并应用适当的控制方法。
第一阶段:冷冻保存
细胞在持续培养过程中会不断积累遗传不稳定性,故收到细胞系后应尽快进行冷冻保存,以确保细胞库遗传特征尽可能接近源材料并降低污染风险。冷冻过程应使用含冷冻保护剂(如DMSO)的方法,并以每分钟1°C的速度缓慢冷冻,以防止细胞内冰晶形成而导致活力损失。
实验步骤:
- 利用显微镜观察细胞,确认其外观正常且未受微生物污染。同时,应确保细胞处于对数生长阶段,细胞密度应符合细胞系指导标准,并且活力大于90%。
- 按照标准传代方法收集并计数细胞。悬浮细胞的冻存密度为每毫升2-5×106个细胞,贴壁细胞则为每毫升1-2×106个细胞。
- 根据细胞系特点,选择合适的冷冻保护剂,并计算所需冷冻液的配方。
- 以200×g离心5分钟,去除上清液,将细胞沉淀重新悬浮于PBS中。
- 再次以200×g离心5分钟,去除上清液。
- 用配置好的冷冻液重悬细胞沉淀,混匀后转移至合适数量的冻存管,并标记重要信息。
- 将冻存管放入冻存盒,置于-80°C冷却一夜,以控制温度下降。
- 最后,将其转移至液氮罐中进行长期保存。
第二阶段:细胞复苏
在需要使用细胞时,务必尽速解冻,以减少对细胞活力的不良影响。建议在复苏过程中通过离心去除冷冻保存剂。
实验步骤:
- 取出液氮储存中的冻存管,并将其置于37°C水浴中轻轻晃动,待细胞解冻至黄豆大小时取出。
- 将1ml的细胞转移至含4ml预热培养基的15ml离心管中,并以200-250×g离心5分钟。
- 去除上清液,重悬细胞沉淀并按合适的接种密度接种于培养容器中。
- 根据细胞类型需求,添加相应的生长因子等组件。
第三阶段:观察
需定期用显微镜及肉眼观察细胞是否存在微生物污染,同时通过显微镜检查细胞健康状态,判断是否需要进行传代培养。
实验步骤:
- 用肉眼观察细胞培养状态,确认无污染。对于贴壁细胞,培养基应清澈如清水;而悬浮细胞因悬浮性会使培养基略显混浊,若混浊度过高且伴随酸性,需考虑传代培养。
- 通过光学显微镜观察细胞生长情况:细胞是否贴壁、细胞形态及融合度等。
- 定期检测细胞以排除支原体污染,并监测其他如细菌、真菌及酵母的污染。
第四阶段:细胞维持和传代培养
当细胞健康生长并达到所需的汇合度时,可以进行传代培养或细胞接种。如细胞未达到预期汇合度且已有2-3天未传代,应更换培养基,直至达到目标状态。出现污染迹象时,需立即处理细胞。
更换培养基:
定期更换培养基以避免有毒代谢物堆积,并确保生长必需成分的供应。培养基的pH值可借助pH指示剂(如酚红)进行监测,以判断何时进行更换。
实验步骤:
- 吸取生长培养基。悬浮细胞需转移至离心管并以200-250×g离心5分钟去除培养基,而贴壁细胞则需倾斜培养容器直接抽取培养基。
- 添加新鲜的生长培养基并将悬浮细胞混匀后转移至新的容器中,或对于贴壁细胞沿容器壁添加新培养基。
- 及时将培养容器放入培养箱,继续监测细胞生长及污染。
传代培养:
当细胞达到所需汇合度或密度时,应实施继代培养,将细胞从当前培养物转移至新培养容器。
实验步骤:
- 清洗并收集细胞,悬浮细胞需再次离心去除培养基并用PBS清洗,重悬于新鲜培养基中;贴壁细胞需通过消化酶分离后清洗。
- 选装适合的传代稀释比,将细胞接种至新培养容器中,并添加生长培养基至所需体积。
- 在培养容器上标注重要信息,如细胞类型、传代次数、接种密度、日期等,并继续孵育。
- 每日监测细胞生长及污染情况。
以上过程皆是为确保细胞培养的质量和效率。而[Z6·尊龙凯时]始终致力于提供优质的细胞培养产品与服务,助力科研工作者在生物医疗领域迈向更高的成就。